此次實(shí)驗(yàn)是以HUVEC細(xì)胞為例，來(lái)介紹腫瘤學(xué)血管生成實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過(guò)程。

圖一  血管生成鏡檢圖

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠　　

　　1）實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱，使膠能過(guò)夜緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）　　

　　2）開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。　　

　　3）打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。　　

　　4）每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

　　由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

　　如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：　　

　　我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

　　如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

　　2  凝膠　

　　1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。　　

　　2）準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。　　

　　3）將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。　　

　　4）將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。　　

　　5）等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

　　3  鋪細(xì)胞　

　　加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，要對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。　　

　　1）準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。　　

　　2）將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。　　

　　3）每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。　　

　　4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。　　

　　5）蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

　　4  采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果　　

　　可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像，并且對(duì)其成管長(zhǎng)度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　5  免疫熒光染色　　

　　根據(jù)需要，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。　

　　1）小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。　　

　　2）加入50μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。　

　　3）在室溫下避光孵育30分鐘。　　

　　4）使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。　　

　　5）使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。